Dopamina (3,4-dihydroksyetyloamina) oprócz adrenaliny i noradrenaliny należy do grupy neuroprzekaźników nazywanych katecholaminami. Charakterystyczną cechą tych związków jest obecność w strukturze cząsteczki reszty aminowej oraz pierścienia benzenowego z dwiema sąsiadującymi grupami hydroksylowymi w pozycji 3´ oraz 4´, czyli katecholu. Ze względu na niskie poziomy katecholamin w próbkach biologicznych, skłonności grup katecholowych do utleniania oraz ich hydrofilowych właściwości, analiza tych związków sprawia ogromne trudności (1-2). Dopamina (DA) bierze udział w regulacji różnych procesów, takich jak: utrzymanie postawy ciała i poruszanie się, zapamiętywanie i uczenie się, interpretowanie bodźców emocjonalnych (1). Dopamina syntetyzowana jest w komórkach chromochłonnych rdzenia nadnerczy, który stanowi wydłużenie współczulnego układu nerwowego (3). Biosynteza dopaminy zaczyna się od aminokwasu L-tyrozyny. Enzym hydroksylaza tyrozynowa katalizuje wprowadzenie drugiej grupy fenolowej, w wyniku czego tworzy się L-dopa, która w następnym etapie ulega dekarboksylacji do DA (reakcja ta katalizowana jest przez enzym o nazwie dekarboksylaza dopy) (4). Dopamina ulega szybkiej metabolizacji pod wpływem O-Metylotransferazy katecholowej (COMT) i oksydazy monoaminowej (MAO). W wyniku działania tych enzymów powstają nieaktywne metabolity. Monoaminooksydaza występuje w dwóch odmianach: MAO-A i MAO-B. Dopamina ulega rozkładowi pod wpływem obu izozymów. Metabolitami DA są: kwas dihydroksyfenylooctowy (DOPAC), 3-metoksytyramina (3-MT) oraz kwas homowanilinowy (HVA) (ryc. 1) (3). Kwas homowanilinowy jest głównym metabolitem dopaminy. Jest aromatycznym kwasem karboksylowym o wzorze C₉H₁₀0₄. Według nazewnictwa IUPAC HVA to kwas 2-(4-hydroksy-3-metoksy-fenylo)octowy (5).

Z danych literaturowych wynika, że zawartość HVA w płynach ustrojowych jest silnie zależna od wieku i maleje wraz z nim (6-9). Oznaczanie zawartości kwasu homowanilinowego w próbkach biologicznych ma istotne znaczenie w diagnostyce klinicznej oraz w badaniach nad patogenezą wielu chorób. Wykrywanie HVA z wykorzystaniem metod chromatograficznych znajduje również zastosowanie w badaniach nad mechanizmem działania leków działających na neurony dopaminergiczne. Oznaczanie głównego metabolitu dopaminy może być także pomocne przy wykrywaniu narkotyków i środków dopingujących. Nieprawidłowe zawartości HVA w płynach ustrojowych oraz tkankach są wynikiem wielu schorzeń, takich jak.: choroba Parkinsona, pląsawica Huntingtona, zespół Costello, epilepsja, dystonia, hipokinezja, nadciśnienie i hipotonia, choroby psychiczne (schizofrenia, manie, depresje), nowotwory (guz chromochłonny oraz występujący we wczesnym dzieciństwie nerwiak niedojrzały) (9-13). Zmienione poziomy HVA w płynach biologicznych mogą również być charakterystyczne dla autyzmu dziecięcego. Niektóre zaburzenia funkcjonowania układu dopaminergicznego mogą być związane z takimi objawami autyzmu, jak: stereotyp zachowań, zaburzenia nastroju, napady agresji, deficyty w sferze komunikacji interpersonalnej. Doświadczalne podanie nadmiernej ilości agonistów (przekaźników zastępczych) receptorów dla dopaminy wywołuje u zwierząt doświadczalnych stereotypie i zwiększoną aktywność ruchową – objawy obserwowane w przebiegu autyzmu u ludzi (14). Wynikiem zbyt dużego pobudzenia neuroprzekaźnika jest tworzenie się toksycznych związków, powodujących uszkodzenia neurologiczne, co przyczynia się do objawów widocznych u autystycznych pacjentów (15). Chociaż u części chorych mogą występować zaburzenia metabolizmu neuroprzekaźników, takich jak dopamina, w ośrodkowym układzie nerwowym, to jednak badania dotyczące neurochemicznych podstaw autyzmu są nadal prowadzone i nie ustalono jeszcze jednoznacznej hipotezy. Opublikowano prace, w których nie stwierdzono znaczących różnic pomiędzy poziomem HVA w płynach biologicznych u dzieci autystycznych i zdrowych. Jednakże wyższy poziom HVA w płynie mózgowo-rdzeniowym został znaleziony u dzieci z zaostrzonymi objawami, zwłaszcza wzmożoną aktywnością ruchową i silnymi stereotypiami. Znaleziono podwyższone stężenia tego kwasu w płynie mózgowo-rdzeniowym u wolnych od lekarstw autystycznych dzieci (16). Część badaczy nie stwierdziła znaczących różnic pomiędzy nieleczonymi autystycznymi dziećmi a zdrowymi pod względem stężenia HVA w moczu i osoczu krwi. Poziom tego kwasu znacząco wzrasta w płynach ustrojowych dzieci autystycznych leczonych środkami neuroleptycznymi (17).

W chemii klinicznej techniki chromatograficzne znalazły szerokie zastosowanie w oznaczaniu kwasu homowanilinowego w matrycy biologicznej. Obok najpowszechniej stosowanych technik łączonych: chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS) oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ED), wymienić tu należy także chromatografię gazową z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, wysokosprawną chromatografię cieczową z detekcją fluoroscencyjną i chemiluminescencyjną. W prezentowanej pracy opracowana została metoda oznaczania kwasu homowanilinowego w moczu z wykorzystaniem chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Ponadto zostały określone poziomy tego kwasu w moczu dzieci zdrowych i dzieci autystycznych.

Materiał badawczy: mocz pochodzący od 52 dzieci autystycznych w przedziale wiekowym od 4 do 11 lat, zdiagnozowanych jako autystyczne pomiędzy trzecim a piątym rokiem życia, rehabilitowane w ośrodku terapeutycznym Navicula – Centrum w Łodzi, oraz dzieci zdrowych (21 dzieci) w tym samym przedziale wiekowym.

Przygotowanie próbek: Do 0,4 ml moczu dodano 10 ul standardu wewnętrznego (0,1 mg/ml kwas malonowy), 0,1 ml 6 M HCl, 0,2 ml nasyconego roztworu NaCl, 0,6 ml mieszaniny octan etylu:eter dietylowy (1:1). Próbkę wytrząsano przez 30 min. Pobraną warstwę organiczną odparowano, dodano 80 ul N,O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamidu (BSTFA) (odczynnik derywatyzujący) i próbkę ogrzewano w temperaturze 60°C aż do odparowania. Następnie rozpuszczono w 0,3 ml chloroformu.

Aparatura pomiarowa: Chromatograf gazowy sprzężony ze spektrometrem mas firmy Agilent Technology. Chromatograf gazowy 6890N Network GC system z kolumną HP-5MS o długości 30 m, średnicy 0,25 mm i grubości filmu fazy stacjonarnej 0,25 um. Spektrometr mas 5973 Network Mass Selective z kwadrupolowym analizatorem mas.

Chromatograf gazowy: Temperatura dozownika 250°C, temperatura pieca 110°C, (9°C/min) 200°C, (30°C/min) 290°C, gaz nośny hel, szybkość przepływu gazu nośnego 0,9 ml/min, objętość nastrzyku 1 ul, nastrzyk w trybie splitless.